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　　遺傳轉(zhuǎn)化通常是以接種的葉盤在固體培養(yǎng)基上誘導愈傷組織和脫分化為基礎的。建立這樣一個復雜系統(tǒng)的過程需要大量的人力和時間。 如果一個品種成功轉(zhuǎn)化，其他品種可能不能用相同的方法轉(zhuǎn)化。此外，即使培育出一個優(yōu)秀的轉(zhuǎn)基因品種，我們應用的機會也很小。在過去的兒十年里，模式植物的分子生物學研究取得了令人矚目的進展。然而，在與人類休戚相關的農(nóng)作物、果樹等經(jīng)濟類植物中，分子水平上的研究卻遠遠落后，無法滿足人們對其改良育種的需要。這其中一個重要的原因就是，迄今為止，轉(zhuǎn)基因、基因突變等分子生物學常規(guī)操作在大多數(shù)植物中依然存在技術瓶頸，需要我們逐一去突破。

　　可喜的是，近些年快速發(fā)展起來的一種被稱為病毒誘導的基因沉默技術有望使這一局面得以改觀。 病毒誘導的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)在植物的基因功能鑒定中是一個非常有用的工具，與傳統(tǒng)的研究植物基因功能的方法相比，具有簡使高效、周期性短、不需要對植物進行轉(zhuǎn)化，以及可以沉默基因家族等特點，并且可以在物種間和物種內(nèi)不同遺傳背景的植物間進行基因功能的比較。而且，盡管VIGS沒有通過穩(wěn)定的植物轉(zhuǎn)化過程，人們近年來發(fā)現(xiàn)其沉默效應也能夠傳遞給后代，這預示著該技術有望在作物改良上發(fā)揮巨大的潛力，應用前景十分廣闊。

　　但是自VIGS技術發(fā)明以來，VIGS載體的應用一直是依賴于植物種的。 直到采用Barley stripe mosaic virus(BSMV)載體沉默大麥(Hordeum wulgare)基因的報道出現(xiàn)，VIGS用于單子葉植物功能基因組的研究才開始起步。近年來，眾多新載體尤其是通用載體的研發(fā)，不斷地拓展VIGS的應用范圍。目前，應用最廣泛的VIGS載體，有Apple latent spherical virus(ALSV)、Barley stripe mosaic virus(BS-MV)以及Tobacco rattle virus(TRV)等。

　　蘋果潛伏球形病毒（ALSV）是一種通過病毒誘導作物轉(zhuǎn)錄基因沉默（VITGS）實現(xiàn)病毒誘導基因沉默（VIGS）、基因表達和表觀遺傳育種的有效系統(tǒng)。 ALSV不一定能感染所有植物，但它能感染多種作物，如蘋果、梨、櫻桃、大豆、豌豆、黃瓜、西瓜、矮牽牛、桔梗和日本龍膽，感染率相對較高。ALSV載體制備和感染的方案在不同出版物之間有所不同，目前仍通過新的實驗條件試驗得到改進，以提高感染率并避免插入序列的缺失。 目前看來，最有代表性的方法實際實驗順序是，載體制備、對本氏煙草進行農(nóng)桿菌侵染、在藜麥中繁殖、病毒顆粒和病毒RNA的提取、最終讓病毒侵染目標植物(例如蘋果) 和日本龍膽。

　　為了讓病毒更有效地侵染目標植物，實驗人員常通過刮傷植物并涂抹病毒溶液的方式增加侵染效率，但這種方式需要耗費大量的人力和時間，于是越來越多的實驗室開始選擇用基因槍轟擊的方式提高病毒侵染效率。

　　Springer在2017年出版的著作《Plant Epigenetics》(植物表觀遺傳學)收錄了日本巖手大學農(nóng)學部植物病理學研究室的文章《Apple Latent Spherical Virus (ALSV) Vector as a Tool for Reverse Genetic Studies and Non-transgenic Breeding of a Variety of Crops》(蘋果潛伏球形病毒(ALSV)載體用于多種作物的反向遺傳研究和非轉(zhuǎn)基因育種)。文章中介紹ALSV載體的特性，以及載體制備和用載體RNA接種植物的實用方案，并給出了用ALSV載體實現(xiàn)VIGS和VITGS的例子。載體RNA接種植物時，實驗室采用了近期引進的GDS-80基因槍系統(tǒng)，并指出相比其他基因槍系統(tǒng)，操作更簡單，ALSV感染率較高，同時該系統(tǒng)的使用也沒有商業(yè)授權使用限制。

　　實驗中，每次轟擊粒子均使用5 ug病毒RNA和0.4 mg金顆粒。文章中介紹了40次轟擊的準備工作，根據(jù)實驗規(guī)模調(diào)整RNA和金顆粒的量。在1.5 mL塑料管中稱出16 mg的金顆粒(0.6 um直徑)。加入50 uL無菌蒸餾水并渦旋振蕩。超聲處理1分鐘。渦旋混合管。將RNA溶液(200 ug RNA，通常為50 uL)一點一點地加入渦旋溶液中。加入10 uL(1/10體積)乙酸銨(5 M)。加入220 uL(兩倍體積)的異丙醇。在-20℃放置1小時。涂有病毒RNA的金顆粒將沉入溶液底部。用移液器除去上清液。渦流一秒鐘。用1mL 100%乙醇(用分子篩脫水)洗滌金顆粒四次。將金顆粒溶于400 uL的100%乙醇(用分子篩脫水)中。超聲處理一秒鐘以分散。

　　轟擊之前必須穩(wěn)定植物樣品：否則植物會被打散并受傷。發(fā)芽后立即將蘋果幼苗綁在柔軟的鋁網(wǎng)之間，用海綿和銅網(wǎng)將龍膽幼苗固定，龍膽幼苗在硬紙板上轟擊，以防止土壤顆粒散布到周圍。向槍管中注入10 uL金顆粒溶液。近距離(1-3厘米)轟擊金顆粒。金顆粒在表面可見為棕色污點。完成所有轟擊后，關閉氦氣瓶閥，并通過反復射擊來除去管內(nèi)的氣體。關閉減壓閥，拆下氣管，然后在水中超聲處理30分鐘，以洗滌槍管。

　　VIGS技術應用于植物研究，在很多方面優(yōu)于其它的基因阻斷方法，這些優(yōu)勢可能還會超出我們的想象。 現(xiàn)階段的VIGS已經(jīng)能夠直接應用于部分農(nóng)作物，如馬鈴薯、番茄、大豆、小麥、大麥、水稻和玉米?？蛇z傳的VIGS也有望直接應用于農(nóng)作物改良，生產(chǎn)出不含轉(zhuǎn)基因成分的基因改良作物，迄今為止，采用VIGS鑒定植物基因功能的探索已超過10年的時間。隨著載體和方法上的繼續(xù)進步，我們相信VIGS必將在這個基因組時代發(fā)揮更重要的作用。

　　參考文獻：

　　1. Kasajima, Ichiro & Ito, Makoto & Yamagishi, Noriko & Yoshikawa, Nobuyuki. (2017). Apple Latent Spherical Virus (ALSV) Vector as a Tool for Reverse Genetic Studies and Non-transgenic Breeding of a Variety of Crops. 10.1007/978-3-319-55520-1_25.

　　2. 孫威, 許奕, 許桂鶯,等. 病毒誘導的基因沉默及其在植物研究中的應用[J]. 生物技術通報, 2015, 31(010):105-110.