廣州熱線

　　由于對(duì)傳統(tǒng)礦物燃料的依賴(lài)，人們對(duì)潛在的能源危機(jī)和環(huán)境問(wèn)題越來(lái)越關(guān)注，為滿(mǎn)足經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展對(duì)能源的需求，實(shí)現(xiàn)資源的永續(xù)利用，促進(jìn)環(huán)境，資源，社會(huì)經(jīng)濟(jì)的協(xié)調(diào)發(fā)展，能源問(wèn)題越來(lái)越受到各國(guó)研究者的重視。微綠球藻是最有前途的生物燃料和天然產(chǎn)品的原料。相比其他生物燃料原料，如作物和其他陸地植物，微綠球藻具有高脂含量和快速增長(zhǎng)的速度。 此外，它們不需要耕地或淡水進(jìn)行種植，可以利用煙氣中的二氧化碳進(jìn)行生長(zhǎng)。微綠球藻是一種很有吸引力的生物燃料和二十碳五烯酸(EPA)等高附加值產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)菌株，其生長(zhǎng)速度快，脂肪含量高。

　　微藻的轉(zhuǎn)化方法主要有三種：玻璃微珠攪拌法、電穿孔法和基因槍粒子轟擊法。 玻璃微珠攪拌和電穿孔通常用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞壁缺乏或變?nèi)醯奈⒃濉?duì)于具有硬細(xì)胞壁的微藻，如硅藻，DNA包覆金屬粒子轟擊靶細(xì)胞是一個(gè)普遍的，簡(jiǎn)單的，有效的和高重現(xiàn)性的轉(zhuǎn)化方法。該方法已成功地用于大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化。基因槍粒子轟擊法的主要缺點(diǎn)是需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備成本，但它仍然是葉綠體轉(zhuǎn)化的最有效的方法，因?yàn)樗试S重組DNA的多個(gè)副本傳輸通過(guò)細(xì)胞膜和葉綠體膜，這增加了成功整合事件發(fā)生的機(jī)會(huì)。此方法已被證明對(duì)于穩(wěn)定的核轉(zhuǎn)化和葉綠體轉(zhuǎn)化、在衣藻轉(zhuǎn)化、團(tuán)藻轉(zhuǎn)化、小球藻、橢圓小球藻、雨生紅球藻瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定的核變換的硅藻三角褐指藻都是有效的。 也是細(xì)胞器轉(zhuǎn)化的首選方法。值得注意的是，葉綠體轉(zhuǎn)化可用于微藻細(xì)胞工廠生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)和增值產(chǎn)品。有一些報(bào)道根據(jù)轉(zhuǎn)化方法描述了轉(zhuǎn)化子的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，90.6%的作者使用了轟擊法，66.6%和33.3%的作者使用了玻璃珠和電穿孔法，報(bào)告了表型的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。這一統(tǒng)計(jì)分析表明，與玻璃珠法和電穿孔法相比，基因槍轟擊后，外源DNA在轉(zhuǎn)化子基因組中的存在與長(zhǎng)期存活正相關(guān)。

　　韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院（KAIST）（也稱(chēng)韓科院，環(huán)太平洋大學(xué)聯(lián)盟成員）化學(xué)與生物分子工程系在Bioresource Technology雜志發(fā)表了使用GDS-80基因槍建立微綠球藻穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系，首次報(bào)道了一種外源熒光蛋白在微綠球藻中的過(guò)度表達(dá)和檢測(cè)，開(kāi)發(fā)了可用于未來(lái)遺傳改良的轉(zhuǎn)化工具箱。 微綠球藻屬于單細(xì)胞，浮游生物，具有2-4um直徑的亞球形或3-4×1.5um圓柱形細(xì)胞，是一種非常小的細(xì)胞類(lèi)型。通過(guò)GDS-80基因槍進(jìn)行粒子轟擊轉(zhuǎn)化，在TUB和UEP啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)Shble，獲得對(duì)Zeocin抗生素的抗性，每10的8次方個(gè)細(xì)胞中分別有5.9和4.7個(gè)轉(zhuǎn)化子。利用限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)定向擴(kuò)增(RESDA)PCR證實(shí)了這些標(biāo)記與基因組的穩(wěn)定整合。

　　實(shí)驗(yàn)方法如下：首先構(gòu)建攜帶內(nèi)源性TUB啟動(dòng)子，TUB終止子和Shble基因(編碼對(duì)zeocin的抗性)的pNsShble質(zhì)粒。通過(guò)乙醇沉淀法純化被Xbal線性化的pNsShble。使用2.5M氯化鈣，和0.1M亞精胺將線性化的pNsShble包埋到金粉上。用70%乙醇洗滌金粉混合液，并重懸于100%乙醇中。在改良的F2N培養(yǎng)基中培養(yǎng)N.salina細(xì)胞。將醋酸纖維素膜濾器上的10的8次方個(gè)細(xì)胞置于F2N瓊脂培養(yǎng)基上。使用GDS-80低壓基因遞送系統(tǒng)(Wealtec，USA)進(jìn)行粒子轟擊：625ug金粉/槍?zhuān)?ug線性化質(zhì)粒，3cm距離。轟擊轉(zhuǎn)化后，將5個(gè)醋酸纖維素膜濾器上的細(xì)胞在改良的F2N液體培養(yǎng)基中于25℃，5umol光子/平方米/s的熒光下培養(yǎng)1天。收獲所有細(xì)胞并接種在含有2.5ug/mL zeocin和F2N瓊脂培養(yǎng)基上。

　　異源蛋白sfCherry熒光蛋白首次在微綠球藻中高表達(dá)和可視化。采用粒子轟擊法，用TUB和UEP啟動(dòng)子表達(dá)Shble基因，每10的8次方個(gè)細(xì)胞分別獲得5.9和4.7個(gè)轉(zhuǎn)化子。經(jīng)RESDA-PCR證實(shí)，基因整合確保了轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達(dá)。 此外，通過(guò)western blotting和共聚焦顯微鏡證實(shí)了sfCherry熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和正確功能。這些結(jié)果為微綠球藻的遺傳操作提供了技術(shù)支持，有助于生物制品的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)。

　　參考文獻(xiàn)：

　　Heterologous overexpression of sfCherry fluorescent protein in Nannochloropsis salina[J]. Biotechnology Reports, 2015, 8(C):10-15.